图2 抗体二硫键还原机制[5]
抗体二硫键还原的机制如图2所示，它实质上是由细胞内的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统引起的可逆氧化还原反应。
二硫键的还原与抗体生产过程的具体参数有关，如果生产过程中细胞发生裂解，则会释放出参与氧化还原反应的蛋白酶，如硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin reductase, TrxR）、谷胱甘肽还原酶（Gluathione reductase，GR）等，以及相关辅助分子（如NADPH等），从而引起药物分子二硫键的还原。其相关影响因素包括：
（1）细胞收获时的剪切力：当对细胞进行收获时，若剪切力过大，会造成更多细胞裂解，从而释放更多的酶和辅助分子引起抗体分子二硫键的还原。
（2）溶氧：当细胞收获液中溶氧不足时，则无法消耗足够的NADPH，从而使其更利于二硫键的还原。
（3）pH：较低pH下NADPH的氧化速率较慢并且部分还原酶会失活。因此，与中性条件相比，抗体在酸性条件下更不易还原[6]。
（4）温度：温度与酶的反应速率密切相关，在低温下储存的细胞培养液可以减慢酶的反应速率，延缓抗体二硫键还原。
（5）放置时间：收获细胞培养液的放置时间一定程度上体现了酶的反应时间。尽快进行后续纯化步骤可以缩短反应时间，降低还原风险。但若存放时间足够长，还原酶活性会渐渐丧失，部分已还原的抗体可能被重新氧化形成完整抗体结构。
（6）培养规模：二硫键的还原与细胞培养规模也有关。小规模的培养环境剪切力更小，氧气传递也更有效，抗体还原程度较低[7]。
三
预防二硫键还原的控制策略
由酶催化的氧化还原反应是二硫键还原最根本的原因，因此，可采用直接/间接抑制或减缓氧化还原反应的方法来减少或避免二硫键还原。
图3 抗体生产中防止或消除二硫键还原的方法[1]
抗体生产中，防止或消除二硫键还原的方法（如图3所示），根据对酶催化的氧化还原反应的影响，可分为如下四类：抑制相关酶表达、抑制酶活、减少产品与酶的接触和反应、降低酶反应速率和缩短反应时间。其中，细胞培养的控制策略可以从以下几点进行：
（1）通过添加抑制剂阻止相关还原酶的表达，从而避免或降低二硫键的还原。但应注意抑制剂的添加不会影响细胞生长以及目标蛋白的表达。
（2）通过添加EDTA、金属离子等抑制相关还原酶的活性，从而避免或降低二硫键的还原。但应考虑在工艺过程中的添加时机以及如何有效去除，从而避免其对产品质量产生其他影响。
（3）通过提高溶氧、引入过氧化氢及L-胱氨酸等可与相关还原酶相互作用的分子，消耗相关还原酶，避免或降低二硫键的还原。
（4）通过减少细胞收获步骤的剪切力，使得相关还原酶的释放减少，避免或降低二硫键的还原。
（5）通过调节细胞收获液的pH以及降低细胞收获液的储存温度，从而延缓二硫键的还原。但使用该策略应注意产品分子质量不受pH和温度调节的影响。
四
凯莱英生物二硫键还原控制策略
二硫键还原是生物技术行业中常需面对的技术挑战，二硫键还原的消除和恢复策略尤其对多特异性抗体及ADC药物的生产 至关重要，特别是在定点偶联如Thiomab中，这类分子表面存在工程化的半胱氨酸，通常在细胞培养中以-S-S-H的形式存在，而表面的二硫键更容易还原，更易于在蛋白合成或纯化过程中分子间发生交联形成聚体。因此，简单有效的控制策略不仅有助于保证产品质量，还能减轻下游纯化的压力，有效提升整个工艺流程的效率。凯莱英生物平台有着丰富的生产放大经验，能够成功避免大规模生产中二硫键还原的问题。以某一项目为例（如图4），使用凯莱英生物还原缩小模型，预测显示大规模生产中极可能出现还原现象（还原缩小模型的CE-NR蛋白纯度较低），而通过凯莱英生物生产团队制定的预防还原控制策略，通过在细胞培养收获、深层过滤以及亲和过程中，采用通气、温度等控制措施，成功避免了蛋白还原，最终使大规模生产的蛋白纯度达到检测标准，保证了产品质量。
图4 蛋白CE-NR纯度AsymBio工艺研发平台的还原控制策略，为客户易还原二硫键分子药物的高质量生产保驾护航！
参考文献
[1] Ren T, Tan Z, Ehamparanathan V, et al. Antibody disulfide bond reduction and recovery during biopharmaceutical process development—A review[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2021, 118(8): 2829-2844.
[2] Lakbub J C , Shipman J T , Desaire H .Recent mass spectrometry-based techniques and considerations for disulfide bond characterization in proteins[J].Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2018.DOI:10.1007/s00216-017-0772-1.
[3] 张莘迪, 范长伟, 宋晓清, 等. 单克隆抗体生产过程中二硫键还原成因及预防方法[J]. **生物工程杂志, 2022, 42(6): 66-75.
[4]The impact of thioredoxin reduction of allosteric disulfide bonds on the therapeutic potential of monoclonal antibodies[J].Journal of Biological Chemistry, 2019, 294(51):jbc.RA119.010637.DOI:10.1074/jbc.RA119.010637.
[5] O’Mara B, Gao Z H, Kuruganti M, et al. Impact of depth filtration on disulfide bond reduction during downstream processing of monoclonal antibodies from CHO cell cultures[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2019, 116(7): 1669-1683.
[6] Xie P , Niu H , Chen X ,et al.Elucidating the effects of pH shift on IgG1 monoclonal antibody acidic charge variant levels in Chinese hamster ovary cell cultures[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2016.DOI:10.1007/s00253-016-7749-4.
[7] Liu H , Nowak C , Shao M ,et al.Impact of cell culture on recombinant monoclonal antibody product heterogeneity[J].Biotechnology Progress, 2016, 32(5):1103-1112.DOI:10.1002/btpr.2327.